研究概要

 核酸、タンパク質、多糖等の生体高分子はそれ自身が天然の超分子です。多くの場合これらは単独はなく、分子間の強調した働きにによって高度な仕事を行っています。この精緻な分子システムの一部、すなわち生命の部品に化学的に少しだけ手を加えてやる(コンジュゲーション)と、生体分子固有の高度な分子認識能と任意の人工機能を併せ持つ新たな分子を創成することができ、さらにコンジュゲート分子間の協同性(アロステリズム)を利用することで結合制御、信号変換、物質変換等の機能、さらには分子マシン、制御されたナノ構造体の多様な分子システムを作り上げることが出来ます。

 

 私たちの研究グループでは、最も制御しやすい反応場として主にDNAを用いて上記目的の達成に向けて研究を行っています。すなわち、DNAコンジュゲート間の共同性に焦点を当て、これを積極的に利用した新規プロービング技術の開発を行っています。複数のプローブ(バイオコンジュゲート)が協調働くと単一のプローブでは成し得ない高度で多彩な機能を発揮します。用いるコンジュゲートの分子設計の多様性に加えてそれらの組み合わせの自由度を考えると無限の展開が可能になります。

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DNAと金属錯体

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ナノ粒子の凝縮

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分子をつなぐ

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DNAの電気化学

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DNAと超分子

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DNAとGO

 

DNAと金属錯体

DNA上での発光性希土類錯体の生成

 DNA末端に金属リガンドを修飾した2種類のDNAコンジュゲートを合成した。スプリットタイプの核酸プローブである。すなわち、両コンジュゲートは、相補的なDNAをテンプレートとして隣り合うサイトに互いのリガンドを向かい合わせて連続的にハイブリダイズする。Eu(III)やTb(III)などの発光性の希土類金属イオンを系中に添加してやると、両コンジュゲートがつくる配位環境に結合して錯体を形成する。

 リガンドとして、EDTAとPhenを用いると、コンジュゲートのテンプレート(ターゲット遺伝子)への塩基配列特異的な結合を、比較的高い量子収率で、Eu(III)、Tb(III)と用いた際には、それぞれ、赤、および緑色の発光として検出することができた。希土類金属錯体の発光はその寿命が著しく長いことが知られているので、時間分解測定法を利用することによりターゲットを高感度に検出することが可能であった。両金属を同時に用いるとアレルタイピングも可能であった。

分子を繋ぐ

光化学ライゲーション

 酵素を使わずに核酸を化学的に連結する化学的ライゲーションには゛酵素反応に適した”化学構造や反応条件という制約がなく、新しい遺伝子操作法、ナノ構造体の構築法などの観点から盛んに研究が行われている。中でも光を駆動力とする光化学ライゲーションは、第3の試薬の添加の必要がないこと、照射光の強度や波長により反応を容易に制御する点が特徴であるが、研究例は大変少ない。

 末端に光反応基であるアントラセンを導入した DNA コンジュゲートを合成したそれぞれ逆末端にアントラセンを導入した2種類のコンジュゲートはターゲットに結合した際にその互いのアントラセンブイが退治するように設定してある複合体形成後光を照射すると相補的な DNA が加えられたサンプルにおいてのみコンジュゲート同士が連結された二量体化生成物が生じた反応は9分で完結し型の光架橋反応であるので延期とのクロスカップリングもないこれまでに snp 解析への適用の可能性を示唆する結果を得ているまたアントラセン周りの部分的構造を改良することでライゲーション効率を向上できることもわかってきた。 

 
 

DNAと超分子化学

シクロデキストリン修飾DNA複合体用でのSNP認識

 β-CyD(β-シクロデキストリン)修飾 DNA と塩基認識能を有する蛍光性小分子とを組み合わせて高選択的塩基識別を行った。2,6-DNSはグアニンと塩基対を形成するナフチリジンと環境応答性の蛍光色素であるダンシルを連結した分子である。ターゲットに対して一塩基ギャップを挟んでタンデムに結合する2種類のプローブ DNA を調整する。このギャップ部位にはホットスポットの塩基が提示され、いずれか一方のプローブのキャップを望む末端に修飾した。2,6-DNS は提示された塩基を識別してギャップにナフチリジン部位を挿入する。さらにそのダンシル部位はすぐ近くに存在するにβ-CyDに包摂されて疎水環境に入り発光する。

バイオアフィニティに基づくナノ粒子の凝集

DNAおよび抗体による分子修飾発光性ナノ粒子の選択的凝集

 R(red)、G(green)、B(blue)、3色の発光性ナノスフェア表面に異なる塩基配列のオリゴヌクレオチドを修飾した。RとGにはそれぞれ、ワイルドタイプ(WT)のターゲットの隣り合うサイトに相補的、RとBには、ミュータント(Mut)の隣り合うサイトに相補的なオリゴヌクレオチドを修飾した。3種スフェア混合溶液にWT、Mutを添加すると、スフェア間を特異的に架橋して、それぞれY(R+G)、M(R+B)の発光体が凝集した。ヘテロ接合体サンプル(WT/Mut)ではW(R+G+B)で発光する凝集体を観察することができた。

 

DNAの電気化学

電気化学的遺伝子センサー

 電極上にはターゲット DNA に相補的なオリゴヌクレオチドを化学修飾した。一方、電気化学的に活性なプローブとしてオリゴヌクレオチド末端にフェロセン化学修飾した(Fc-ODN)。両者は、ターゲットの隣り合うサイトに相補的であるFc-ODN溶液にこの電極を浸漬した。この溶液にターゲットDNAが添加されると、電極上でサンドイッチ複合体(タンデム2本鎖)が形成する。すなわち、ターゲット添加によって、フェロセンが電極上に濃縮されるため、ターゲットの存在を電流値の著しい増加として検知することができた 

 

DNAとGO

GOを利用したバイオセンシング

 1本鎖DNAは、塩基部位との疎水性相互作用などにより酸化グラフェン(GO)表面に吸着する。一方、2本鎖DNAは塩基部位が構造内側に隠れるため、GOとの相互作用は弱い。GOは強力な消光能をもつため、Goに蛍光ラベル化1本鎖(プローブ)を吸着させると、その発光は抑制される。そこに相補鎖(cDNA)を添加すると、二本鎖形成に伴いプローブが溶液中に遊離するため、蛍光が回復する。この原理を利用し、様々なバイオセンサーの開発が試みられている。